Flora intestinală (microbiomul): compoziție și funcții

Studii recente evidenţiază rolul cheie al florei intestinale, nu doar în ceea ce privește digestia, ci și pentru metabolism. Se pare că microbiota este implicată într-un număr de afecţiuni, de la obezitate până la colita ulcerativă, astfel că o mai bună înţelegere a funcţiilor microbiotei ar putea deschide noi posibilităţi terapeutice.

Flora intestinală, denumită și microbiom sau microbiotă reprezintă o comunitate complexă de micro-organisme, care trăiesc în interiorul tractului digestiv al oamenilor [1] și animalelor.

Flora intestinală umană cuprinde cel mai mare număr de bacterii, comparativ cu alte zone ale organismului. Flora intestinală se dezvoltă complet în jurul vârstei de 2 ani [2], alături de epiteliu și bariera mucoasă, acestea două din urmă fiind tolerante şi chiar susținând microbiota, care acționează precum o barieră împotriva agenților patogeni [4,5]. Microorganismele aduc beneficii gazdei prin fermentarea unor substraturi energetice ca fibrele vegetale din dietă, și prin antrenarea sistemului imunitar prin intermediul produșilor finali de metabolism ca propionatul și acetatul [3].

Bacteriile intestinale sunt de asemenea utile prin sinteza vitaminelor B și K, precum și prin rolul lor în metabolizarea acizilor biliari, sterolilor și xenobioticelor [2]. Acizii grași cu lanț scurt și celelalte substanțe produse sub acțiunea florei intestinale acționează ca și hormoni, flora intestinală în sine comportându-se ca un organ endocrin [7]; perturbarea florei s-a dovedit responsabilă de apariția afecțiunilor inflamatorii și autoimune [1,6].

Microbiota previne creșterea la nivel intestinal a unor specii nocive de bacterii [4], contribuie la dezvoltarea intestinului și produce hormoni care intervin în stimularea depozitării grăsimilor în organism [2]. Modificarea severă și dezechilibrul microbiotei (sau genomului acesteia) sunt asociate cu obezitatea [9]. În anumite condiții, unele specii din flora intestinală pot îmbolnăvi organismul gazdă, cauzând infecții sau crescând riscul de cancer al gazdei [7,12].

Compoziţia florei intestinale

a) în funcţie de segmentul de tract digestiv

Compoziția microbiotei intestinale se modifică de-a lungul vieții, fiind influențată de transformările care survin în dietă, dar și în starea de sănătate [3,7]. Această compoziție variază și în funcție de segmentul de tract digestiv. În stomac și în intestinul subțire este prezent un număr redus de specii bacteriene [1,3]. Ca urmare a mediului gastric acid, majoritatea microorganismelor nu pot supraviețui. Principalele specii bacteriene care colonizează stomacul sunt Streptococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Peptostreptococcus, și unele tipuri de drojdii [2] .

Intestinul subțire conține doar urme de microorganisme, deoarece este aflat în vecinătatea stomacului. Bacteriile predominant întâlnite la acest nivel sunt coci și bacili gram-pozitivi [2]. Totuși, în intestinul subţire distal, mediul alcalin permite existența bacteriilor gram-negative de tipul Enterobacteriaceae [3]. Flora intestinului subțire susține funcțiile acestuia, oferind semnale reglatorii care permit dezvoltarea acestuia.

La nivelul colonului întâlnim cel mai bogat ecosistem microbian din corpul uman, cu până la 10 celule per gram de conținut intestinal [12] și cu 300 până la 1.000 de specii bacteriene diferite [1,2]. Circa 99% din flora colonului este reprezentată de 30-40 de specii [7], Faecalibacterium prausnitzii fiind specia cel mai frecvent întâlnită la adulții sănătoși [3]. Bacteriile intestinale constituie până la 60% din greutatea materiilor fecale [2].

Câteva exemple de bacterii întâlnite frecvent la nivelul colonului: Klebsiella sp.: 40-80%, Clostridium perfrigens: 25-35%, Bifidobacterium bifidum: 30-70%, Lactobacillus: 20-60%, Enterococcus faecalis: 100%, Peptococcus, Peptostretococcus, Staphylococcus aureus: 30-50%, Enterobacter sp.: 40-80%, Bacteroides fragilis.

Deși fungii, virusurile (de tip bacteriofagi) și organismele tip arhea fac parte din flora intestinală, se cunosc puține despre activitatea acestora [1]. 99% din microbiota colonului și din fecale se constituie din bacterii strict anaerobe ca Bacteroides și Bifidobacterium [3]. Factorii care perturbă această populație microbiană sunt reprezentați de antibiotice, stres și paraziți [2]. Chiar dacă 99% din microbiotă este reprezentată de anaerobi, la nivelul cecului există o mare densitate de bacterii aerobe [2]. Se estimează că flora intestinală ar conține de sute de ori mai multe gene decât genomul uman [12]. Populațiile microbiene variază de la un individ la altul [5,12].

b) în funcţie de tipurile de bacterii

Cele patru încrengături bacteriene dominante din intestinul uman sunt Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria şi Proteobacteria [2]. Majoritatea bacteriilor aparțin genurilor Bacteroides, Clostridium, Faecalibacterium [7,3], Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus şi Bifidobacterium. Alte genuri ca Escherichia și Lactobacillus sunt prezente, dar într-un număr mai mic [7]. Genul Bacteroides constituie cam 30% din totalul bacteriilor din intestin, sugerând faptul că ar juca un rol important pentru organismul uman [3].

Genurile de fungi care au fost descoperite la nivel intestinal sunt reprezentate de Candida, Saccharomyces, Aspergillus, Penicillium, Rhodotorula, Trametes, Pleospora, Sclerotinia, Bullera și Galactomyces [1,2]. Rhodotorula este frecvent observată la pacienții cu boală inflamatorie intestinală, iar Candida la cei cu hepatită și ciroză hepatică cu virus B [1]. Organismele tip arhea sunt importante în metabolizarea produșilor bacterieni de fermentație. Pentru studierea florei intestinale se folosește extragerea acizilor nucleici din specimenele de bacterii din materiile fecale, îndeosebi secvențe de gene rRNA 16S.

c) în funcţie de vârstă

Diversitatea compoziției microbiotei din probele de materii fecale este semnificativ mai mare la adulți, decât la copii [3]. În microbiomul adult se observă o prevalență mare de enzime implicate în fermentație și în metabolismul argininei, glutamatului, aspartatului și lizinei. Prin contrast, în microbiomul sugarului, enzimele dominante sunt cele implicate în metabolismul cisteinei și în procesele de fermentație [5].

Studiile au identificat asocierea dintre diferite genuri bacteriene din microbiotă și aportul de nutrienți. Microflora este compusă, în principal, din trei enterotipuri: Prevotella, Bacteroides și Ruminococcus. S-a observat o asociere între concentrația fiecărei comunități microbiene și dietă. De exemplu, Prevotella este legată de consumul de carbohidrați și zaharuri simple, în timp ce Bacteroides – cu proteine, aminoacizi și grăsimi saturate. Bacteriile specializate care descompun mucina, supraviețuiesc pe baza excreției de carbohidrați ai gazdei [3]. Un anumit enterotip va domina în funcție de dietă [2].

Copiii malnutriți vor avea o floră intestinală mai puțin diversificată, comparativ cu cei sănătoși, iar schimbările microbiomului, ca urmare a deficitului de nutrienți pot constitui o cauză de malnutriție [5,3]. Copiii malnutriți tind să aibă o floră potențial patogenă, precum și mai multe drojdii la nivelul cavității bucale și gâtului.

d) în funcţie de proveniența geografică a pacientului

Compoziția microbiomului depinde și de originea geografică a pacienților. Variații ale conținutului de Prevotella, a ponderii genei pentru urează și a genelor care codifică sinteza și degradarea glutamatului, precum și a altor enzime implicate în degradarea aminoacizilor sau în biosinteza vitaminelor, au arătat diferențe semnificative între pacienții din SUA, Malawi și cei de origine amerindiană [7].

Spre exemplu, populația americană prezintă la nivelul microbiotei un procent reprezentativ de enzime care degradează glutamina și enzime implicate în biosinteza vitaminelor și acidului lipoic; populațiile din Malawi și cele amerindiene au un procent mai mare de enzime implicate în sinteza glutamatului precum și o suprareprezentare a alfa-amilazei. Deoarece oamenii din SUA au o dietă mai bogată în grăsimi, alimentația este probabil un determinant major al compoziției bacteriene intestinale [3].

Unele studii au arătat diferențe în microbiota copiilor europeni versus cea a celor din zonele rurale africane. Dieta copiilor africani este săracă în proteine și grăsimi de origine animală, dar bogată în proteine și polizaharide vegetale, flora intestinală fiind dominată de Bacteroidetes, pe când microbiota copiilor europeni este dominată de genul Firmicutes și prezintă o reducere marcantă a biodiversității. Compoziția diferită și biodiversitatea crescută ale florei intestinale a populațiilor africane contribuie la digestia polizaharidelor vegetale și la scăderea incidenței bolilor colonice non-infecțioase.

Colonizarea tractului intestinal

Tractul gastrointestinal al fetusului este steril, deși poate apărea colonizarea microbiană, după cum demonstrează un studiu în care specii de Lactobacillus și Bifidobacterium erau prezente în biopsiile placentare [2,4]. În timpul nașterii și imediat după aceea, bacteriile de la mamă și din mediul înconjurător colonizează intestinul sugarului [5]. Populațiile bacteriene inițiale sunt, în general, organisme facultativ anaerobe, acestea scăzând concentrația de oxigen din intestin și astfel permițând bacteriilor exclusiv anaerobe ca Bacteroides, Actinobacteria, și Firmicutes să colonizeze intestinul și să se dezvolte la acest nivel [7].

Copiii alimentați la sân au o floră dominată de bifidobacterii, posibil ca urmare a conținutului laptelui matern în factori de creștere pentru aceste bacterii și în prebiotice. Microbiota sugarilor alăptați cu formule de lapte are o diversitate mai mare, cu concentraţii mai mari de Enterobacteriaceae, enterococci, bifidobacterii, Bacteroides şi clostridii [2].

Funcţiile florei intestinale

Rolurile florei bacteriene sunt: apărare directă împotriva patogenilor, întărirea sistemului imunitar al gazdei (dezvoltarea şi menţinerea epiteliului intestinal), inducerea producerii de anticorpi la nivelul acestuia, metabolizarea unor compuşi altminteri nedigerabili din alimente [6].

Flora intestinală joacă un rol direct în apărarea împotriva agenţilor patogeni prin colonizarea completă a spaţiului, utilizarea tuturor nutrienţilor disponibili şi secreţia unor compuşi care omoară sau inhibă organisme nedorite cu care ar intra în competiţie pentru nutrienți [7]. Perturbarea florei permite organismelor competitive în expectativă, precum Clostridium difficile să se stabilească la nivel intestinal [5].

Mucoasa intestinală oferă un strat extern în care microorganismele „prietenoase” se pot ancora şi se pot hrăni şi un strat intern, pe care nici măcar aceste bacterii comensale nu îl pot penetra [1,4]. Simultan cu dezvoltarea microbiotei, apare ţesutul limfoid asociat intestinului (GALT), care face parte din epiteliul intestinal şi care detectează și reacţionează la agenţi patogeni [6]. Ţesutul GALT este tolerant faţă de speciile din flora intestinală, dar nu şi faţă de alte microorganisme [4]. GALT este, în mod normal, tolerant faţă de alimentele la care este expus sugarul, şi faţă de produșii de digestie din alimente şi metaboliţii florei intestinale [5].

Specii bacteriene diferite din flora intestinală s-au dovedit a avea capacitatea de a dirija sistemul imunitar spre producerea selectivă de citokine; de exemplu Bacteroides fragilis şi unele specii de Clostridia par să iniţieze răspuns antiinflamator, în timp ce unele bacterii filamentoase segmentate stimulează producerea de citokine inflamatorii [4]. Flora intestinală poate de asemenea regla producerea de anticorpi de către sistemul imunitar [1,6]. Aceste citokine şi anticorpi pot avea efecte şi extradigestiv, la nivelul plămânilor şi altor ţesuturi [5].

Fără floră intestinală, corpul uman ar fi incapabil să utilizeze unii carbohidraţi nedigerabili, deoarece unele bacterii din floră posedă enzime pentru degradarea anumitor polizaharide, enzime care lipsesc din celulele umane [5]. Rozătoarele crescute într-un mediu steril şi cărora le lipsea flora intestinală, au avut nevoie să consume cu 30% mai multe calorii, doar ca să rămână la aceeaşi greutate ca cele normale [7]. Carbohidrații pe care oamenii nu îi pot digera fără ajutorul bacteriilor comensale includ anumite tipuri de amidon, fibre, oligozaharide şi zaharuri pe care altminteri corpul eșuează în a le digera şi absorbi, precum lactoza, în cazul intoleranţei la lactoză [3,12].

Bacteriile din microbiotă transformă carbohidrații în acizi graşi cu lanţ scurt (SCFAs) prin procesul de fermentaţie saccharolitică [12]. Produşii acestui proces sunt acidul acetic, acidul propionic şi acidul butiric, care pot fi folosiţi de celulele gazdei umane, oferind o sursă majoră de energie şi de nutrienţi, şi ajutând organismul să absoarbă minerale esenţiale din dietă precum calciu, magneziu şi fier [7]. Gazele şi acizii organici precum acidul lactic sunt rezultatul fermentaţiei saccharolitice [12]. Acidul acetic este utilizat de către mușchi, acidul propionic ajută ficatul să producă ATP, iar acidul butiric oferă energie celulelor intestinale. Dovezile existente sugerează că bacteriile comensale cresc absorbţia şi depozitarea lipidelor şi ulterior facilitează absorbţia vitaminelor precum vitamina K [1].

Flora intestinală sintetizează vitamine precum biotina şi folatul, şi ajută la absorbţia microelementelor din alimente, precum magneziu, calciu şi fier. Organismele tip arhea care produc metan, ca de exemplu Methanobrevibacter smithii sunt implicate în îndepărtarea/eliminarea metaboliţilor finali ai fermentaţiei bacteriene, ca de exemplu hidrogenul [2].

Axul creier-intestin reprezintă comunicarea biochimică care se desfăşoară între tractul gastrointestinal şi sistemul nervos central [1]. Recent, acest termen a fost extins pentru a sublinia rolul florei comensale. Acest ax cuprinde sistemul nervos central, sistemele neuroendocrine şi neuroimune, inclusiv axul hipotalamo-hipofizo-adrenal, componenetele simpatic şi parasimpatic ale sistemului nervos autonom, incluzând sistemul nervos enteric, nervul vag şi microbiota intestinală [2,7].

Flora intestinală şi bolile

Alterarea numărului de bacterii intestinale, ca de exemplu în urma tratamentului antibiotic, poate afecta sănătatea gazdei şi capacitatea de digestie a alimentelor [7]. Antibioticele pot provoca diaree prin iritarea directă a intestinului, modificarea nivelurilor florei intestinale, permiţând bacteriilor patogene să se dezvolte [4]. Un alt efect nociv al antibioticelor este creşterea numărului de bacterii rezistente la antibiotice, dificil de tratat [6].

Modificarea numerelor şi a speciilor din flora intestinală poate reduce capacitatea corpului de a fermenta carbohidrații și de a metaboliza acizii biliari, cauzând diaree. Carbohidrații nedigeraţi absorb prea multă apă şi provoacă scaune apoase, iar lipsa acizilor graşi cu lanţ scurt produşi de către flora intestinală poate provoca diaree [11].

Reducerea numărului de specii bacteriene comensale determină scăderea abilităţii acestora de a inhiba dezvoltarea speciilor nocive precum C. difficile şi Salmonella kedougou [4]. Alterările compoziţiei florei intestinale apar şi în bolile severe din cauza ischemiei intestinale, compromiterii sistemului imunitar şi anorexiei.

Prezenţa sau abundenţa unor bacterii în tractul digestiv poate contribui la apariţia bolii inflamatorii intestinale [6]. Metaboliţii unor specii din flora intestinală pot influenţa căile de semnalizare ale gazdei, contribuind la afecţiuni ca obezitatea şi cancerul de colon [9]. Se pare că interacțiunile florei intestinale cu axul creier-intestin joacă un rol în bolile inflamatorii intestinale cronice, stresul psihologic mediat prin axul hipotalamo-hipofizo-adrenal [8] dirijând modificările epiteliului intestinal, flora intestinală eliberând în schimb factori şi metaboliți care declanșează semnalizarea în sistemul nervos enteric şi în nervul vag [5].

Diversitatea florei comensale este scăzută la aceşti pacienţi cu boli inflamatorii intestinale. La pacienţii cu colită ulcerativă, în microbiotă domină Proteobacteria şi Actinobacteria; la cei cu boală Crohn, se constată supraexpresia Enterococcus faecium şi a mai multor specii de Proteobacteria [1,9].

Studiile au arătat schimbări ale microbiotei la pacienţii cu sindrom de intestin iritabil, schimbări diferite în funcţie de predominanţa diareei sau a constipaţiei. Se observă şi o scădere a diversităţii microbiomului, cu niveluri scăzute de Lactobacilli şi Bifidobacteria, niveluri mari de bacterii facultativ anaerobe ca Escherichia coli, şi un raport crescut Firmicutes:Bacteroidetes [5].

S-ar părea că relaţia florei comensale cu gazda intervine şi în mecanismul unor boli precum alergii, astm bronşic şi diabet zaharat tip 2 [9]. Implicarea microbiotei în aceste afecţiuni autoimune ar avea la bază expunerea insuficientă la patogeni a copiilor din ţările dezvoltate (care ar duce la un sistem imun hiperreactiv) şi dieta de tip vestic, săracă în fibre vegetale şi bogată în zaharuri – acestea ar explica alterările florei intestinale şi ale rolului acesteia în modularea sistemului imunitar [6].

Flora comensală este implicată în obezitate şi în sindromul metabolic. Dieta de tip vestic determină alterări ale florei intestinale şi astfel modifică procentul de energie derivată din alimente şi modul cum este utilizată această energie [8,10]. Dietei de tip vestic îi lipsesc fibrele şi alţi carbohidraţi complecși, necesari pentru dezvoltarea unei flore intestinale sănătoase. Modificările apărute în flora comensală ca răspuns la dieta de tip vestic par să intensifice cantitatea de energie generată de flora intestinală, contribuind la apariția obezității [8]. Există dovezi că microbiota influenţează comportamentul alimentar în funcţie de preferinţele microbiotei, ceea ce duce la consumul de către gazdă a unei cantităţi mai mari de alimente şi eventual la obezitate. Cu cât diversitatea microbiomului intestinal este mai mare, cu atât microbiota va consuma mai multă energie şi resurse, în competiţia cu celelalte microbiote şi va manipula mai puţin gazda [8].

Se pare că lipidele intestinale reglează homeostazia glucozei prin implicarea axei intestin-creier-ficat (acesta din urmă menţine balanţa între preluarea şi stocarea glucozei prin glicogenogeneză şi gluconeogeneză). Administrarea directă de lipide în intestinul subţire creşte nivelurile de acid gras cu lanţ lung-acil coenzima A la acest nivel şi suprimă producerea de glucoză, chiar şi în condiţii de vagotomie subdiafragmatică sau deaferentarea vagală a intestinului. Apar astfel posibilităţi noi de tratament pentru obezitate şi diabet zaharat [8,9].

Disbioza intestinală a fost asociată cu apariţia cirozei şi bolii hepatice steatozice non-alcoolice [9]. Translocarea florei intestinale apare atunci când bacteriile comensale depăşesc mucoasa intestinală, ceea ce poate duce la infecţii severe. Un studiu din 2014 a sugerat că administrarea de antibiotice se asociază cu supraponderalitate şi obezitate la copii, îndeosebi la copiii cu mai mult de 4 expuneri la antibioticele cu spectru larg [9]. Unele genuri bacteriene, ca Bacteroides şi Clostridium, au fost asociate cu creşterea multiplicării tumorale, în timp ce altele, precum Lactobacillus şi Bifidobacteria, previn apariţia tumorilor [1,12].

Microbiota şi noile „uşi” terapeutice

Probioticele sunt microorganisme cu beneficii pentru sănătate şi sunt utile în tratamentul unor afecţiuni precum sindromul de colon iritabil [5,12]. ( ex. Streptococcus faecium).

Un studiu sistematic din 2016 a descoperit că anumite tulpini din microbiotă ca Bifidobacterium şi Lactobacillus genera s-au dovedit a fi potenţial utile în tratamentul afecţiunilor sistemului nervos central, precum tulburări de dispoziţie (anxietate, depresie), tulburări de memorie [8,11].

Administrarea de probiotice conţinând Lactobacillus poate preveni diareea indusă de antibiotice, iar probioticele pe bază de Saccharomyces (Saccharomyces boulardii) pot preveni infecţia cu Clostridium difficile după tratament antibiotic [1].

Există dovezi că echilibrarea florei comensale cu ajutorul probioticelor care conţin Lactobacilli şi Bifidobacteria poate reduce durerea viscerală şi inflamaţia intestinală la pacienţii cu boli inflamatorii intestinale [6].

Un tratament emergent pentru infecţia cu C. difficile presupune transplant de microbiotă fecală de la donori sănătoşi cu rate de succes de 90%, prin restabilirea echilibrului între clasele Bacteroides şi Firmicutes [7]. Transplantul fecal a avut rezultate bune în unele studii şi la pacienţii cu boală inflamatorie intestinală (Crohn, colită ulcerativă).

Administrarea de probiotice de tipul Lactobacillus rhamnosus într-un studiu a favorizat pierderea ponderală la femeile obeze, administrat pe o perioadă de 12 săptămâni. Pacientele respective au continuat să piardă în greutate chiar şi după sistarea administrării probioticului.
Pacienţii cu ciroză hepatică şi encefalopatie hepatică minimă cărora li s-au administrat preparate probiotice au prezentat ameliorarea testelor neuropsihometrice (70%), probioticele fiind la fel de eficiente ca şi lactuloza [11]. S-ar părea că microbiota intestinală deschide astfel posibilităţi terapeutice atractive, impactul acestora rămânând să fie evaluat pe viitor.

Articol de Dr. Claudia Mihaela Vasiliu, medic specialist gastroenterologie
Sursa articol: Revista Galenus

Bibliografie:
1. Quigley EM (2013). “Gut bacteria in health and disease”. Gastroenterol Hepatol (N Y). 9: 560–9. PMC 3983973. PMID 24729765.
2. Saxena, R.; Sharma, V.K (2016). “A Metagenomic Insight Into the Human Microbiome: Its Implications in Health and Disease”. In D. Kumar; S. Antonarakis. Medical and Health Genomics. Elsevier Science. p. 117. doi:10.1016/B978-0-12-420196-5.00009-5. ISBN 978-0-12-799922-7.
3. Lozupone, Catherine A.; Stombaugh, Jesse I.; (2012). “Diversity, stability and resilience of the human gut microbiota” Nature. 489 (7415): 220–30. Bibcode:2012Natur.489.220L. doi:10.1038/nature11550. PMC 3577372. PMID 22972295.
4. Yoon MY, Lee K, Yoon SS (2014). “Protective role of gut commensal microbes against intestinal infections”. J Microbiol. 52 (12): 983–9. doi:10.1007/s12275-014-4655-2. PMID 25467115.
5. Sommer F, Bäckhed F (2013). “The gut microbiota – masters of host development and physiology”. Nat Rev Microbiol. 11 (4): 227–38. doi:10.1038/nrmicro2974. PMID 23435359.
6. Shen S, Wong CH (2016). “Bugging inflammation: role of the gut microbiota”. Clin Transl Immunology (Review). 5 (4): e72. doi:10.1038/cti.2016.12. PMC 4855262. PMID 27195115.
7. Knight, DJW; Girling, KJ (2003). “Gut flora in health and disease”. The Lancet. 361 (9371): 512–9.
8. Wang H, Lee IS, Braun C(July 2016). “Effect of probiotics on central nervous system functions in animals and humans – a systematic review”. J. Neurogastroenterol Motil. doi:10.5056/jnm16018. PMID 27413138.
9. Boulangé CL; et al. (2016). “Impact of the gut microbiota on inflammation, obesity, and metabolic disease”. Genome Med. (Review). 8 (1): 42. doi:10.1186/s13073-016-0303-2. PMC 4839080 . PMID 27098727.
10. Bailey LC, Forrest CB, Zhang P, DeRusso P. 2014. “Association of antibiotics in infancy with early childhood obesity”. JAMA pediatr 168(11):1063-9.
11. Pratap Mouli V et al. “Effect of probiotic VSL#3 in the treatment of minimal hepatic encephalopathy: A non-inferiority randomized controlled trial”. Hepatol Res. Epub 2014 Sep 29.
12. University of Glasgow. 2005. “The normal gut flora”. Available through web archive. Accessed May 22, 2008.